W zeszłym tygodniu podzieliliśmy się kilkoma rozważaniami na temat stosowania elektroforezy membranowej z octanu celulozy i dzisiaj zakończymy ten temat w celach informacyjnych.
Wybór Stężenie buforu
Stężenie buforu stosowane w elektroforezie membranowej z octanu celulozy jest na ogół niższe niż stosowane w elektroforezie papierowej.Powszechnie stosowany pH 8,6BBufor arbitrażowy jest zazwyczaj wybierany w zakresie od 0,05 mol/l do 0,09 mol/l.Przy doborze stężenia dokonuje się wstępnego ustalenia.Przykładowo, jeśli długość paska membrany pomiędzy elektrodami w komorze elektroforezy wynosi 8-10cm, wymagane jest napięcie 25V na centymetr długości membrany, a natężenie prądu powinno wynosić 0,4-0,5 mA na centymetr szerokości membrany.Jeżeli wartości te nie zostaną osiągnięte lub przekroczone podczas elektroforezy, należy zwiększyć stężenie buforu lub rozcieńczyć.
Zbyt niskie stężenie buforu spowoduje szybki ruch pasm i zwiększenie szerokości pasma.Z drugiej strony zbyt wysokie stężenie buforu spowolni migrację pasm, utrudniając rozróżnienie niektórych pasm separacji.
Należy zauważyć, że w elektroforezie membranowej z octanu celulozy znaczna część prądu przepływa przez próbkę, co generuje znaczną ilość ciepła.Czasami wybrane stężenie buforu może zostać uznane za właściwe.Jednakże w warunkach podwyższonej temperatury otoczenia lub przy zastosowaniu wyższego napięcia może nastąpić intensyfikacja parowania wody pod wpływem ciepła, co może skutkować zbyt wysokim stężeniem buforu, a nawet wysuszeniem membrany.
Próbka objętości
W elektroforezie membranowej z octanu celulozy wielkość próbki zależy od różnych czynników, w tym warunków elektroforezy, właściwości samej próbki, metod barwienia i technik wykrywania.Ogólną zasadą jest, że im bardziej czuła jest metoda wykrywania, tym mniejsza może być objętość próbki, co jest korzystne przy separacji.Jeżeli objętość próbki jest nadmierna, wzory rozdziału elektroforetycznego mogą nie być wyraźne, a barwienie może być również czasochłonne.Jednakże przy analizie ilościowej rozdzielonych wybarwionych pasm metodami detekcji kolorymetrycznej elucyjnej, objętość próbki nie powinna być zbyt mała, ponieważ może to skutkować niższymi wartościami absorbancji dla niektórych składników, co może prowadzić do większych błędów w obliczaniu ich zawartości.W takich przypadkach należy odpowiednio zwiększyć objętość próbki.
Zwykle objętość próbki dodawana na każdy centymetr linii nanoszenia próbki mieści się w zakresie od 0,1 do 5 µl, co odpowiada ilości próbki od 5 do 1000 µg.Na przykład w rutynowej analizie elektroforezy białek surowicy objętość próbki dodawana na każdy centymetr linii nałożenia na ogół nie przekracza 1 µl, co odpowiada 60–80 µg białka.Jednakże w przypadku analizy lipoprotein lub glikoprotein tą samą metodą elektroforezy należy odpowiednio zwiększyć objętość próbki.
Podsumowując, należy wybrać najbardziej odpowiednią objętość próbki w oparciu o określone warunki w drodze serii wstępnych eksperymentów.
Wybór roztworu barwiącego
Oddzielone prążki podczas elektroforezy na membranie z octanu celulozy są zazwyczaj barwione przed wykryciem.Różne składniki próbki wymagają różnych metod barwienia, a metody barwienia odpowiednie do elektroforezy membranowej z octanu celulozy mogą nie mieć całkowitego zastosowania w przypadku bibuły filtracyjnej.
Istnieją trzy główne zasady wyboru roztworu barwiącegomembrana z octanu celulozy.Po pierwsze,Barwniki rozpuszczalne w wodzie powinny być preferowane w stosunku do barwników rozpuszczalnych w alkoholu, aby uniknąć skurczu i deformacji membrany spowodowanej roztworem barwiącym tego ostatniego.Po barwieniu ważne jest przepłukanie membrany wodą i zminimalizowanie czasu trwania barwienia.W przeciwnym razie membrana może się zwinąć lub skurczyć, co może mieć wpływ na późniejsze wykrywanie.
Po drugie, lepiej jest wybierać barwniki o silnym powinowactwie barwiącym próbkę.W elektroforezie białek surowicy na membranie octanu celulozy powszechnie stosuje się czerń aminową 10B ze względu na jej silne powinowactwo barwiące do różnych składników białek surowicy i jej stabilność.
Po trzecie, należy wybierać barwniki niezawodnej jakości.Niektóre barwniki, pomimo tej samej nazwy, mogą zawierać zanieczyszczenia, które powodują szczególnie ciemne tło po zabarwieniu.Może to nawet zamazać pierwotnie dobrze oddzielone pasma, utrudniając ich rozróżnienie.
Na koniec ważny jest wybór stężenia roztworu barwiącego.Teoretycznie mogłoby się wydawać, że wyższe stężenie roztworu barwiącego doprowadzi do dokładniejszego wybarwienia składników próbki i uzyskania lepszych wyników barwienia.Jednak tak nie jest.Powinowactwo wiązania składników próbki z barwnikiem ma pewną granicę, która nie zwiększa się wraz ze wzrostem stężenia roztworu barwiącego.Wręcz przeciwnie, zbyt wysokie stężenie roztworu barwiącego nie tylko marnuje barwnik, ale także utrudnia uzyskanie przejrzystego tła.Ponadto, gdy intensywność barwy osiąga pewną wartość maksymalną, krzywa absorbancji barwnika nie przebiega w zależności liniowej, zwłaszcza w pomiarach ilościowych. W elektroforezie membranowej z octanu celulozy stężenie roztworu barwiącego jest na ogół niższe niż stosowane w elektroforezie papierowej.
Szczegółowe informacje na temat biotechnologii Beijing Liuyi's membrana z octanu celulozyzbiornik do elektroforezy i jego zastosowanie do elektroforezy, odwiedź tutaj:
lEksperyment oddzielania białka surowicy przez membranę z octanu celulozy
lElektroforeza membranowa z octanu celulozy
lStosując elektroforezę membranową z octanu celulozy, należy pamiętać o kilku kwestiach (1)
Jeśli masz plan zakupów naszych produktów, nie wahaj się z nami skontaktować.Możesz wysłać nam wiadomość na e-mail[e-mail chroniony]Lub[e-mail chroniony]lub zadzwoń do nas pod numer +86 15810650221 lub dodaj Whatsapp +86 15810650221 lub Wechat: 15810650221.
Odniesienie:Elektroforeza (wydanie drugie) autorstwa pana Li
Czas publikacji: 6 czerwca 2023 r